【目的】阐明蜡样芽孢杆菌NJSZ-13中杀线蛋白酶ATP-α与ClpX的杀线分子机制，构建杀线蛋白酶ATP-α与ClpX的原核表达载体。【方法】克隆杀线蛋白酶编码基因atpA与clpX，利用基因工程手段对杀线蛋白酶编码基因进行PCR扩增，并与载体pET-21b连接构建重组载体，提取重组质粒转入蛋白表达载体大肠杆菌BL21(DE3)。利用菌落PCR和测序验证转化效果。加入IPTG诱导蛋白表达，使用Ni-NTA柱进行重组蛋白的纯化，利用SDS-PAGE与Western blot验证ATP-α与ClpX纯化效果并进行杀线活性测定。【结果】菌落PCR验证和测序表明，重组载体中含有蛋白酶编码基因atpA与clpX，且基因序列与参考序列一致，证明目的基因已经成功插入BL21(DE3)表达载体中。SDSPAGE与Western blot验证表明，重组蛋白得到正确诱导与纯化，成功构建杀线蛋白酶ATP-α与ClpX的原核表达载体。杀线活性测定结果表明ATP-α与ClpX均具有较强的杀线效果。ATP-α在72 h达到66.75%的杀线率，ClpX在72 h达到75.46%的杀线率。同时，两个蛋白酶共同作用杀线能力显著增强，24 h便达到66.32%的杀线率，72 h杀线率达到91.01%。【结论】ATP-α与ClpX经原核表达及纯化后具有较高的杀线活性，且两者共同处理松材线虫，杀线效果更强，证明蛋白酶ATP-α与ClpX是重要的杀线因子，为设计和筛选杀线药物提供了新的线索和依据。